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PGD (Diagnóstico Genético Pré-Implantacional)

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Alterações cromossômicas são comprovadamente responsáveis pela maioria dos abortamentos e por grande parte das falhas de implantação quando não se encontram outros fatores que as possam justificar.

Desde 1995, os grandes centros de reprodução assistida passaram a analisar geneticamente os embriões formados a partir da técnica de fertilização in vitro. Estudos realizados em embriões humanos demonstraram que aproximadamente 50% possuem alterações cromossômicas.

O diagnóstico genético pré-implantacional consiste em biopsiar os embriões após a fertilização in vitro retirando-se algumas células e posteriormente analisar essas células para diagnosticar possíveis alterações cromossômicas, como por exemplo a Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, Síndrome de Patau; antes de transferir o embrião para o útero materno. O PGD também nos permite identificar o sexo dos pré-embriões, a fim de evitarmos graves doenças transmitidas de mãe para filho, como a hemofilia tipo A.

Inicialmente, o diagnóstico genético pré-implantacional, ou PGD, era realizado em conjunto com a técnica de FISH (hibridização in sito por imunofluorescência), método capaz de detectar alterações numéricas em até nove cromossomos, e somente eram biopsiados embriões em estágio de clivagem, ou seja, no 3° dia de desenvolvimento.

Com o surgimento de uma nova técnica, o CGH-array, agora podemos realizar a análise de todos os cromossomos de um embrião, e fazer mais diagnósticos que antes não eram possíveis.

A ciência evoluiu muito nessa área e hoje contamos com avanços como a biópsia de blastocistos e com a possibilidade de fazer diagnósticos de doenças monogênicas por PCR (reação em cadeia da polimerase) de mais de 200 doenças como a talassemia, a distrofia muscular de Duchenne, a fibrose cística e a neurofibromatose.

Os embriões com alterações cromossômicas ou genéticas, em sua maioria, não implantam no útero, mas se há implantação pode resultar em abortamento ou no nascimento de uma criança que carrega consigo alguma anomalia.

O diagnóstico pré-natal de anomalias cromossômicas e genéticas só era possível através de biópsia de vilo coriônico ou amniocentese, realizados no primeiro trimestre de gestação (a partir de 11 semanas de gestação) seguido de análise bioquímica, molecular ou citogenética das células retiradas do concepto, ou detectando-se o sexo do feto no caso de doenças recessivas ligadas ao cromossomo X.

Com o advento da fertilização in vitro, tornou-se possível desenvolver uma técnica para avaliar os embriões antes de serem transferidos ao útero materno, diagnóstico genético pré-implantacional (PGD). Aplicada com sucesso pela primeira vez em 1990 por Handyside et al, em Londres, a biópsia embrionária com PGD abriu as portas para uma nova era na área de reprodução humana assistida.

A biópsia embrionária pode ser realizada a partir do terceiro dia de desenvolvimento do embrião, no momento em que apresenta de 6 a 8 células. O procedimento consiste na extração de 1 ou 2 células (se realizado no 3° dia de desenvolvimento) até o número de 15 (se a biópsia for em fase de blastocisto).

Indicação

A técnica é indicada para casais com risco de transmissão de doenças cromossômicas ou genéticas que desejam evitar a gestação de crianças afetadas, abortamentos de repetição e também pode ser realizada para mulheres com mais de 40 anos, quando a chance de aneuploidias (alteração numérica dos cromossomos do embrião) aumenta.

Os pacientes devem sempre passar por aconselhamento genético-reprodutivo geral prévio, realizando o histórico familiar detalhado e a análise cromossômica dos cônjuges ou o rastreamento de genes alterados, se for o caso.

As tecnologias empregadas têm diferentes objetivos e métodos, pode-se testar um embrião para mutação direta de doenças monogênicas utilizando protocolos com PCR (reação em cadeia de polimerase), ou seleção do sexo por hibridização in situ fluorescente (FISH) para doenças ligadas ao X e outras síndromes cromossômicas.

FISH

Todos os cromossomos podem ser avaliados, mas rotineiramente são utilizadas até 9 sondas pelo método de FISH, os principais cromossomos avaliados são 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X e Y. Nesta técnica, uma sonda (pedaço de DNA que reconhece uma região específica de um cromossomo), ligada a um fluorocromo (corante fluorescente que brilha com uma cor determinada para cada sonda) é submetida a um tratamento que faz com que ela reconheça os cromossomos que estão presentes naquele blastômero e assim visualizam-se quantos cromossomos existem para cada sonda testada.

Outro avanço do PGD foi a transferência de embriões no estágio de blastocisto (5º dia), permitindo uma seleção mais precisa, uma vez que os embriões biopsiados em dia +3 são transferidos atualmente no dia +5, desde que normais para o exame e com continuidade no seu desenvolvimento. Sabe-se que 50% dos embriões em desenvolvimento no 3° dia não atingem o estágio de blastocisto, e que 70% dos embriões morfologicamente normais são aneuploides (cromossomicamente anormais), portanto, o fato de um embrião chegar a esta fase não significa que ele seja geneticamente perfeito. Em suma, a transferência pode ser cancelada caso nenhum embrião chegue a blastocisto, ou se nenhum dos blastocistos presentes forem normais.

Outra vantagem da transferência em blastocisto é a sincronia do estágio embrionário com o endométrio, com melhoria das taxas de implantação.

PGD Trissomia

Visualização do FISH, cada cromossomo adquire uma coloração específica.

CGH-array (Hibridização genômica comparativa)

Uma nova tecnologia baseada em array-CGH é análoga a técnica de cariótipo convencional por analisar todo o genoma, porém apresenta a vantagem de uma resolução 10 a 100 vezes maior.

A técnica permite a identificação em alta resolução de anomalias cromossômicas, permitindo uma caracterização segura de alterações associadas com anomalias de desenvolvimento, susceptibilidade a doenças e respostas a fármacos diferenciados.

Atualmente, é amplamente utilizado na genética clínica no intuito de diagnosticar enfermidades como o retardo mental “sem causa aparente”, ou no diagnóstico preciso de alterações cromossômicas muito pequenas, quando não é possível o diagnóstico através de um cariótipo convencional. Essa nova tecnologia é muito promissora principalmente para casais com translocações cromossômicas e em mulheres com idade superior a 37 anos.

O CGH apresenta algumas limitações na avaliação de alterações genéticas e cromossômicas: não detecta rearranjos equilibrados e nem poliploidias.

A técnica de CGH tem fornecido dados úteis referentes à aneuploidias e mosaicismo em oócitos e embriões humanos, porém sua aplicação foi prejudicada devido a longa duração dos protocolos normais, que exigem um tempo de análise de 3 ou mais dias. No entanto, através da criopreservação dos embriões ou oócitos biopsiados torna-se possível a obtenção de resultados e a transferência dos embriões selecionados em outro ciclo. Outra possibilidade é a realização da transferência no estágio de blastocisto, no caso da biópsia em oócito.

Portanto, a hibridização genômica comparativa, utilizando microarrays, tem sido aplicada com sucesso no PGD para a detecção de aneuploidias. Esta abordagem tem permitido que a análise dos cromossomos seja realizada em menos de 30 horas, dentro do prazo necessário para que os oócitos e embriões, inclusive blastocistos, classificados como normais sejam transferidos, sem haver a necessidade de criopreservação.

PGD 2

Utilização do CGH no PGD – Análise de todos os cromossomos.

PCR

Esta tecnologia permite a avaliação de genes específicos, através de sequenciamento de DNA e microssatélites. Conhecendo-se a doença procurada pode-se identificar a sequência de genes alterados no DNA e diagnosticar o embrião como portador ou não de doença.

Com esta técnica, podemos identificar mais de 600 doenças gênicas.

BIÓPSIA DE BLASTOCISTO

Atualmente, realizamos biópsia no próprio blastocisto, no 5° dia de desenvolvimento, pois esta técnica proporciona inúmeras vantagens para a análise genética pré-implantacional, as células do blastocisto ultrapassam as instabilidades cromossômicas dos primeiros 3 a 4 dias de desenvolvimento e desta forma evita resultados falsos ou tendenciosos, uma vez que permite a análise de até 15 células, reduzindo muito a probabilidade de erros em relação ao mosaicismo.

PGD Blastocisto

Conclusão

O PGD é uma técnica segura, de grande precisão, que evoluiu rapidamente ao longo dos últimos anos. Com esta técnica, melhoramos a seleção para a transferência de embriões cromossomicamente e geneticamente normais para as doenças estudadas, melhorando a implantação e reduzindo as taxas de abortamento. Existe a possibilidade de não haver embriões para transferência ao realizar biópsia com PGD por FISH no dia +3, uma vez que 50% dos embriões que se encontram no 3° dia de desenvolvimento não chegam ao 5° dia.

A biópsia de blastocisto tem resultados mais precisos, por permitir a análise de maior número de células.

De acordo com a avaliação do aconselhamento genético reprodutivo, serão utilizadas diferentes técnicas para o PGD.

Atualmente, podemos identificar mais de 600 doenças gênicas através do PGD, evitando assim a transmissão dessas doenças para próximas gerações com segurança e alta precisão nos resultados.

PGD (Diagnóstico Genético Pré-Implantacional)

 

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